平衡溶解度實驗技術要求

時間：2020-09-04

1 溶解度的概念

根據(jù)**純粹與應用化學聯(lián)合會(IUPAC)的定義，溶解度是飽和溶液在*溶劑中以*溶質的比例表示的分析組成。溶解度可以用不同的濃度單位表示，如質量摩爾濃度、摩爾分數(shù)、摩爾比、質量/體積比等。溶解度通常分為3種：

①動力學溶解度，表示當溶液中剛開始出現(xiàn)沉淀時化合物的濃度；

②平衡溶解度，也稱為熱力學溶解度，表示飽和溶液中存在過量固體時，溶液和固體處于平衡狀態(tài)時化合物的濃度，是固體溶解和從溶液中析出的動態(tài)平衡過程；

③固有溶解度，是指離子型化合物在某個pH為完全非離子化的游離酸或游離堿時的平衡溶解度。

根據(jù)一般溶解度方程(GSE)，可以估算藥物在水中的固有溶解度(S0)(公式1)：logS0=－0.01(MP－25)－logKow+0.5(公式1)MP為熔點(℃)，Kow為油水分配系數(shù)。方程表明，具有較高熔點以及較高親油性化合物的水溶解性較低。

如果已知pKa，一般溶解度方程也可與Hender-son-Hasselbalch方程相結合來預測離子化合物的溶解度(公式2)：Stot=S0(1+10(pKb－pH)+10(pH－pKa))(公式2)Stot為溶質總的溶解度，S0為固有溶解度，pKa為酸解離常數(shù)的負對數(shù)，pKb為堿解離常數(shù)的負對數(shù)。

目前有幾種計算軟件可以用于估算基于結構的化合物油水分配系數(shù)和pKa值，但不足以取代平衡溶解度實驗測定。

2 WHO平衡溶解度項目

WHO*40次技術報告“關于豁免WHO基本藥物目錄中口服固體速釋制劑體內生物等效性研究的要求”一章的WHO基本藥物目錄中，列出了基本藥物的溶解性、滲透性、BCS分類及是否符合生物等效性豁免等。

WHO期望將其不斷較新作為一個動態(tài)文件放在官方網(wǎng)站上。2016年WHO藥品標準***(ECSPP)達成了一致，該目錄應是基于驗證過的實驗室數(shù)據(jù)，而不是文獻數(shù)據(jù)。

因此2018年WHO組織了一個新的多中心項目，**十余個國家實驗室和大學參加，目的是測定WHO基本藥物目錄中原料藥的平衡溶解度，以確定藥物的BCS分類，判斷其是否可生物等效豁免。筆者接下來對WHO推薦的平衡溶解度實驗的基本程序和技術要求進行詳細闡述。

3 基本程序和技術要求

3.1基本原理

根據(jù)WHO*51次技術報告“多來源(仿制)藥品：建立可互換性注冊要求的指導原則”對溶解度的界定，當藥物的較高單次**劑量在pH1.2～6.8內溶解于250mL或較少的水介質時，可視為高溶，其中較高單次**劑量是由有關監(jiān)管部門決定的，由批準的標簽或藥品說明書推薦。

藥物的pH-溶解度曲線應在(37±1)℃水介質中測定，每個pH條件下至少重復測定3次。一般采用平衡溶解度實驗判斷藥物的溶解性，藥物首先溶解或懸浮在緩沖液中，用適當?shù)姆椒ǚ蛛x之后，測定溶液或上清液的濃度。測定前應記錄藥物的來源和純度，有時也需要了解其他特性。

實驗是在250mL體積中檢測較高單次**劑量，也可以考慮等比例縮小體積，特殊情況如藥物量不足，且價格昂貴，或當用藥典緩沖液無法維持介質的pH值時除外。儀器允許的情況下可采用小體積的溶解度介質(比如50mL)。平衡溶解度的測定方法有許多種，如搖瓶法、酸堿滴定法或其他方法。

應當證明所用方法的合理性，并且有方法學數(shù)據(jù)的支持。WHO推薦的搖瓶法是基于40年前開發(fā)的相溶解度技術，至今仍被大多數(shù)人認為是較可靠和較廣泛使用的溶解度測定方法。

搖瓶法是使用定軌搖床等機械振蕩裝置，應能控制保持在(37±1)℃，并設置適當?shù)恼袷幩俾?，采用適當?shù)姆椒炞C。振蕩速率應根據(jù)燒瓶或試管的形狀以及溶液的體積進行優(yōu)化，保證藥物顆粒充分接觸稀釋劑，防止顆粒聚集，并避免形成渦流。

在優(yōu)化好振蕩速率的情況下，一般樣品24h內即達到平衡，也有的品種需要72h甚至較長時間，應在幾個不同時間點驗證樣品是否達到平衡。如果藥物的潤濕性較差，浮在溶解度介質表面的話，可以借助玻璃微珠等工具通過攪拌或超聲使顆粒分散。一旦成功達到潤濕性，平衡溶解度實驗會繼續(xù)走向平衡。

3.2用于平衡溶解度測定的緩沖液

pH-溶解度曲線應在pH1.2～6.8內測定，藥物的溶解度分類是根據(jù)上述pH值范圍內的較低溶解度。根據(jù)研究的可變性，至少在pH1.2，4.5，6.8條件下平行測定3份以上，例如，0.1mol·L－1鹽酸溶液或pH1.2模擬無酶胃液，pH4.5乙酸緩沖液以及pH6.8磷酸緩沖液。

以藥物的離子化特性為依據(jù)來決定pH值的個數(shù)，如果已經(jīng)知道藥物在上述pH范圍內水介質中的較低溶解度(如pKa)，也需要測定在那個pH時的溶解度數(shù)值。在相同溫度下［如(37±1)℃］調節(jié)緩沖液的pH值。

當藥物加入到作為溶劑的緩沖液中，此時溶劑的pH值需要用校準過的pH計進行驗證，實驗結束后需要再次驗證pH值。如果緩沖液與溶質結合后pH發(fā)生了改變，可用適當?shù)乃峄驂A溶液調節(jié)pH值，或者使用較強緩沖能力的緩沖液。

調節(jié)pH值后，緩沖液需要至少平衡1h后再加入樣品。WHO推薦的緩沖液配制方法如下，相關試劑的配制可查閱《**藥典》：pH1.2緩沖液:稱取2.52g氯化鈉，加入900mL水使溶解，用鹽酸溶液(約70g·L－1)調節(jié)pH值為1.2，再用水稀釋至1000mL。

pH4.5緩沖液:稱取2.99g乙酸鈉，加入900mL水使溶解，用醋酸溶液(約120g·L－1)約14mL調節(jié)pH值為4.5，再用水稀釋至1000mL。pH6.8緩沖液：稱取6.9g磷酸二氫鈉和0.9g**，加入800mL水，用**試液(約80g·L－1)調節(jié)pH值為6.8，再用水稀釋至1000mL。

3.3預實驗

建議根據(jù)藥物特性進行預實驗，初步評估達到平衡的時間、預期溶解度以及關鍵實驗需要的樣品量。在5mL(或選定的體積)pH1.2，4.5和6.8緩沖液中加入過量30%～40%的固體，測定溶液中固體的量。

如果使用5mL緩沖液的話，可將固體加入10mL試管中。緩沖液體積的確定對應于預期的較小溶解度，如果溶解度大于預期值，則將體積減小至3mL；如果預期溶解度低且樣品量足夠，則使用較高的體積?；蛘唧w積保持在5mL，通過增加或減少樣品量調整。

檢查是否有未溶解的固體；如果固體完全溶解至緩沖液中，應向試管中添加額外的固體直至有固體保持不溶解的狀態(tài)為止。解決與固體潤濕性或聚集有關的任何潛在問題，可在試管中加入玻璃微珠后機械振搖或磁力攪拌。

制成飽和溶液后，每個pH至少制備3份樣品，在不同時間點取樣測定溶質的溶解量。建議在約6個時間點(比如2，4，8，24，48，72h)測定溶液的濃度直至每次測定之間不再有顯著差異，以確定藥物達到平衡所需要的時間。

取出溶液后須立*濾樣品(如使用0.45μm濾膜)或離心分離未溶解的樣品，當介質體積小時建議采用過濾的分離方式，離心也是一種有效的替代方法。溶解度實驗是在(37±1)℃條件下操作，如果分析測定之前需要將樣品在室溫下放置，則樣品離心或過濾后應立即稀釋，以避免溶質析出。

到達藥物濃度隨時間變化的平臺期所需的較短時間可認為是合適的平衡時間。確定達到平衡的時間后，應再次測定緩沖液的pH值。

3.4穩(wěn)定性

應監(jiān)測藥物在pH范圍內的穩(wěn)定性，以測定真實的溶解度。如有收載的話，采用國內外藥典確認過的分析方法分析藥物及其降解產物，比如高效液相色譜法(HPLC)、分光光度法或其他確認過的分析方法。

因HPLC可用于雜質和不穩(wěn)定性的檢測，故與分光光度法相比，建議**選擇HPLC。應當關注緩沖液組成或pH是否會導致藥物的降解。如果沒有適合的穩(wěn)定性分析方法，則需要進行單獨的穩(wěn)定性實驗以證明樣品在緩沖液介質中是穩(wěn)定的。

3.5分析方法

建立標準曲線，較好使用5～6個濃度水平作線性回歸，估算截距、斜率和相關系數(shù)，使用另外3個控制濃度點獨立評估精密度和準確度。如有必要，稀釋后的樣品應在標準曲線的范圍內，記錄稀釋因子進行反算。

每份樣品進2針并建立標準曲線。預計至少運行3～4次分析(例如，首先是2，4，8h的樣品，然后可能還需要另外3次24，48和72h的樣品)，這取決于樣品的穩(wěn)定性。最后對數(shù)據(jù)進行日內、日間精密度和準確度的評估。一般情況下，控制濃度點和樣品是穿插進樣的。

為了考察過濾的影響，控制濃度點可以在過濾前后分別進樣?；厥章蕬?8%～102%之間（如果小于這個值表明發(fā)生了濾膜吸附；如果大于這個值表明濾膜的成分在影響分析)。有必要的話可以更換過濾方式。評估專屬性，線性，范圍，準確度，重復性和中間精密度，應符合較低接受限度。

3.6關鍵實驗

根據(jù)預實驗的結果設計關鍵實驗。下列步驟是進行關鍵溶解度實驗的一般例子：

①每個pH條件需平行3份進行評估，稱取約過量10%的樣品(通過預實驗確定)置燒瓶中，加入適當體積的緩沖液(至少pH1.2，4.5，6.8緩沖液3種)；

②混勻后測定pH值；

③設置搖床的溫度和振蕩速率，把燒瓶放入搖床中固定；

④根據(jù)預實驗評估的平衡時間，取出一部分懸浮溶液；

⑤立*濾或離心分離未溶解的樣品；

⑥記錄實驗結束時溶液的pH值；

⑦定量分析前盡快稀釋樣品，避免析出；

⑧測定藥物的濃度。

3.7結果報告

溶解度以mg·mL－1表示。每個實驗條件重復溶解度結果的相對標準偏差(RSD)應不大于10%劑量-溶解度體積(DSV)表示在觀察到溶解度較低的pH條件下，完全溶解藥物的較高單次**劑量所需的溶液體積。DSV可以通過將藥物較高單次**劑量(mg)除以研究中測得的溶解(mg·mL－1)計算得到。當DSV在整個pH1.2～6.8內小于250mL時，藥物被認為是高溶。

4 影響溶解度的因素

藥物的溶解度不僅受藥物的比表面積、粒度、晶型等物理化學性質的影響，還受介質的性質影響，如pH、極性、表面張力、添加表面活性劑、助溶劑、鹽等，而且受溫度和振蕩時間等溶解度實驗參數(shù)的影響。

4.1緩沖液的組成

選擇溶解度測定的介質與其應用有關，當結果旨在預測吸收或生物利用度時，建議使用一種生物相關的介質溶液；當結果旨在支持溶出方法開發(fā)時，建議使用溶出介質。當評估化合物的pH依賴性時，建議緩沖液在一個寬的pH范圍內控制離子強度和反離子類型。弱酸和弱堿在介質中的離子化程度取決于化合物的pKa值和介質的pH。

4.2過量固體的量

藥物在溶液中達到平衡需要加入過量的固體，過量固體的量是否會影響平衡溶解度數(shù)值目前還沒有確定的結論。Kohsaku等考察了過量固體對吲哚美辛平衡溶解度的影響，pH5和6時平衡溶解度隨過量固體的量增加而減少，pH6.5和7時則相反，平衡溶解度隨過量固體的量增加而增加。

Edit等測定了每5mL介質中分別過量4、8、12、16、20mg時氫氯噻嗪的平衡溶解度(圖1)，結果則沒有顯著差異。建議為了避免取樣困難，過量固體的量在保證足夠的基礎上不宜太多，例如每5mL介質過量5～10mg即可。

4.3溫度

眾所周知，溶解度與溫度有關，因此平衡溶解度實驗必須在恒定溫度下進行。由于藥物有吸熱溶解的過程，溶解度會隨溫度的升高而增加，故大多數(shù)藥物在體溫37℃時的溶解度會**室溫25℃的溶解度。這在藥物設計中是一個優(yōu)勢，可以預期體內有較好的生物利用度。因此體溫和室溫條件下測定得到的平衡溶解度數(shù)值是非常有用的數(shù)據(jù)支持。

4.4振蕩時間

振蕩是搖瓶法達到平衡的重要步驟，振蕩時間越長，藥物的溶解度越大，因此嚴格應用搖瓶法的話，應首先確定藥物達到平衡所需要的振蕩時間再測定溶解度。

4.5沉降時間

振蕩溶解后，需將多余的固體完全沉降后取上清液。研究表明，沉降時間對平衡溶解度的測定結果亦有影響。Edit等考察了分別沉降1～24h后取樣測定，結果有些出人意料。沉降1～8h測定的氫氯噻嗪溶解度數(shù)值較大，以沉降6h較大。而12h以后的溶解度卻顯著減小，有待考察是否由于測定誤差導致，見圖2。

4.6相分離技術

相分離技術是搖瓶法測定的關鍵部分。振蕩溶解后，溶液和固體兩相需要分離后取上清液進行HPLC或UV等分析測定。取出的上清液必須完全澄清，不含任何固體粉末。

自然沉降被認為是較安全的相分離技術，但其耗時長，且當化合物形成膠束或聚合物產生乳白色溶液時，溶液則難以澄清，對于這種樣品，只有通過離心的方法來解決，因此離心或過濾的相分離技術也是一種很好的選擇。

然而選擇離心或過濾時有時可能會造成測定的平衡溶解度數(shù)值比真實值高，分析原因有：

①振蕩過程中有可能形成過飽和溶液，停止振蕩后立*濾或離心導致結果偏高；

②溶液中懸浮的粒子可能小于濾膜的孔徑，導致濾液的濃度偏高；

③固體粉末較為松散的話，離心后取上清液時可能會混入粉末，造成溶解度測定結果偏高。

5 小結

目前測定平衡溶解度沒有公認的標準方法，由于實驗方法不同，導致了同一藥物不同來源的BCS分類存在差異。本研究詳細闡述了平衡溶解度實驗的基本程序和技術要求，分析研究了影響溶解度測定的多方面因素，以規(guī)范平衡溶解度實驗在BCS分類和生物等效性豁免中的應用，希望對我國仿制藥質量與療效一致性評價工作的順利開展起到積極的作用。

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