提取染色體DNA和質(zhì)粒DNA的方法

時間：2020-01-05作者：杭州廣旭地坪工程有限公司瀏覽：764

一、質(zhì)粒構(gòu)建原理

在堿性條件下，染色體DNA和質(zhì)粒DNA都發(fā)生變性，但質(zhì)粒DNA的**螺旋共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的兩條互補(bǔ)鏈不會*分離，當(dāng)用酸性的高鹽緩沖液將pH中和至中性時，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)到原來的構(gòu)型并溶解在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。通過離心，纏結(jié)的染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。上清液中的質(zhì)粒DNA因不溶于70％的乙醇，可在加入乙醇后通過離心得到質(zhì)粒DNA沉淀。

二、質(zhì)粒構(gòu)建試劑

1、LB培養(yǎng)基

蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g加重蒸水950ml，待*溶解后，用1N NaOH調(diào)pH至7.0，補(bǔ)加重蒸水至總體積1000ml，151bf/in2高壓蒸氣滅菌20分鐘。

2、氨芐青霉素：100mg/ml

3、溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖；25mmol/L Tris—HCl(pH8.0)；10mmol/L EDAT(pH8.0)

4、溶液Ⅱ(臨用時配)：0.2mol/L NaOH，1％SDS

5、溶液Ⅲ：0.5mol/L乙酸鉀60ml；冰乙酸11.5ml；H2O28.5ml

6、酚－氯仿：將酚和氯仿等體積混合后用0.1mol/L Tris－HCl (pH7.6)抽提幾次以平衡這一混合物，置棕色玻璃瓶中，上面覆蓋0.01mol/L Tris－HCl (pH7.6)液層，4℃保存。

7、氯仿－異戊醇：將氯仿和異戊醇按24：1的比例混合。

8、TE緩沖液(pH8.0)：10mol/L Tris-HCl(pH8.0)；1mmol/L EDAT

9、RNase 1mg/ml：稱10mg RNase于Eppendorf管中，溶于1ml 10mmol/L Tris-HCl(pH7.5)、15mmol/L NaCl溶液中，于100℃加熱15分鐘，緩慢冷卻至室溫，此液為10mg/ml RNase濃度，應(yīng)用時稀釋至1mg/ml。

10、70％乙醇、無水乙醇

三、質(zhì)粒構(gòu)建操作

1、將含有pBS-SK質(zhì)粒的大腸桿菌XL1-blue 10μl接種到10ml含氨芐青霉素(100μg /ml)的LB培養(yǎng)液中，37℃振搖過液。

2、取1.5ml菌液轉(zhuǎn)入Eppendorf管中，5000rpm離心1分鐘，吸凈上清。

3、將細(xì)菌沉淀重懸于100μl用冰預(yù)冷的溶液Ⅰ中，劇烈振蕩。

4、加200μl新配制的溶液Ⅱ，蓋緊管口，輕緩顛倒Eppendorf管5次，以混合內(nèi)容物，禁止劇烈振蕩。置冰浴中放置5分鐘。

5、加150μl用冰預(yù)冷的溶液Ⅲ，蓋緊管口，反復(fù)顛倒數(shù)次，使溶液Ⅲ在粘稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻，隨后置冰浴中5分鐘。

6、用微量臺式高速離心機(jī)12000rpm 離心5分鐘，將上清轉(zhuǎn)入另一Eppendorf管中。

7、加等體積酚－氯仿，劇烈振蕩1分鐘后，12000rpm離心5分鐘，將上層液轉(zhuǎn)入另一Eppendorf管中。

8、加等體積氯仿－異戊醇，劇烈振蕩10秒鐘后，短暫離心12000rpm1分鐘，將上層液轉(zhuǎn)入另一Eppendorf管中。

9、室溫下加2倍體積的無水乙醇，振蕩混合，室溫下靜置5分鐘。

10、12000rpm離心5分鐘，去上清液，加1ml 70％乙醇，短暫振搖，然后再離心(12000rpm

 分鐘)。

11、除去所有上清液，待待殘余乙醇揮發(fā)干凈后，加30μlTE緩沖液(pH8.0)溶解沉淀，加1μl RNase (1mg/ml)，37℃保溫15分鐘，取出后即可用于酶切分析或置-20℃保存?zhèn)溆谩?/span>


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• 提取染色體DNA和質(zhì)粒DNA的方法

  一、質(zhì)粒構(gòu)建原理 在堿性條件下，染色體DNA和質(zhì)粒DNA都發(fā)生變性，但質(zhì)粒DNA的**螺旋共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的兩條互補(bǔ)鏈不會*分離，當(dāng)用酸性的高鹽緩沖液將pH中和至中性時，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)到原來的構(gòu)型并溶解在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。通過離心，纏結(jié)的染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。上清液中的質(zhì)粒DNA因不溶于70％的乙

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